液态活检——循环肿瘤细胞计数

　　前列腺癌特异抗原在临床应用中其敏感度和特异性存在一定的局限性，所以早期准确诊断前列腺癌仍需更加精准的标志物。同时，对于转移性前列腺癌（metastatic prostate cancer， mPCa）、去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer， CRPC)等进行预后的判断、治疗疗效的实时定量监测仍是临床上需要改善的问题。作为指导前列腺癌个体化诊疗的一种新手段，“循环肿瘤细胞（circulating tumor cells ，CTCs）和循环肿瘤DNA（circulating tumour DNA，ctDNA）”能够为早期诊断前列腺癌、实时监测转移性前列腺癌的疗效提供更有效的临床证据。目前临床常用的主要是CTCs和ctDNA，已有较多研究探索了CTCs和ctDNA在前列腺癌诊疗过程中的应用前景。其中，美国FDA相继在2004~2008年间批准外周血CTCs计数可用于转移性乳腺癌，结直肠癌和前列腺癌的预后评估和治疗反应情况的评估。

CTCs的概念及生物学特征

　　Ashworth于1896 年首次发现并提出CTCs的概念。1889年Paget提出了著名的“种子和土壤”假说（seed and soil hypothesis），该假说中的“种子”即是CTCs，其在肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用，此学说成功地阐释了癌症复发和转移的机理。肿瘤原发灶或者转移灶中，具有转移倾向一类肿瘤细胞，通过上皮间质转化等生物学行为，迁移入血后，称之为CTCs，其可分为具有干细胞特征的CTCs和不具有干细胞特征的CTCs。CTCs一旦迁徙入血，其存活时间一般较短，通常不会超过24h，CTCs在外周血中的存在依赖于细胞复制和凋亡之间的平衡。

　　外周血中检测出CTC并不一定意味着患者已经存在远处转移，具有干细胞特征的播散的肿瘤细胞（disseminated tumor cells， DTCs）聚集成团，并且形成微转移灶，同时该转移灶可以逃避免疫系统的识别，肿瘤的远处转移才可能发生。在肿瘤的浸润和转移过程中，肿瘤细胞发生上皮-间叶转换（epithelial mesenchymal transition， EMT），从而使其更容易侵入血管内皮而进入血循环。同时，标记物角蛋白（cytokeratin， CK）、上皮细胞粘附分子（EpCAM）和波形蛋白的表达水平也发生了变化。理论上讲，肿瘤大小超过2 mm左右时便可诱导血管生成进入肿瘤，Husemann等通过动物研究证实在小鼠的早期肿瘤阶段，外周血中可以检测到CTCs，而且随着肿瘤逐渐增大，CTCs的数量呈指数级别上升。

　　基于CTCs的生物学特征，CTCs的检测可有效地应用于肿瘤的体外早期诊断，指导肿瘤的个体化治疗。另一方面通过对CTCs的进一步分析，亦可用于检测恶性肿瘤的分子表达谱从而指导临床治疗或者探索肿瘤在发生发展过程中的分子生物学行为。

CTCs的检测方法进展

　　由于CTCs在外周血中的数量很少，每105-107个有核细胞中才有一个CTCs，因此对 CTCs的检测技术要求更为准确、敏感。CTCs的检测方法主要分为两部分：CTC富集技术和CTC检测技术。其中一种富集、检测方法如下示意图:

CTCs在前列腺癌中的临床应用

　　辅助诊断 既往文献已报道CTCs检测可用于乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌筛查和诊断。Schwarzenbach等入组了69例前列腺癌患者，结果发现71% M0期、92% M1期患者外周血内分别检测出1-40个CTCs，且CTCs的出现与肿瘤分期（P＜0.03）及增高的Gleason评分（P＜0.04）具有相关性，提示CTCs检测可协同PSA指导前列腺癌患者预后分期分组。

　　CTCs与前列腺癌分期分级关联尚有争议。另一项研究结果显示，在局限性前列腺癌患者中，CTCs数量与肿瘤大小、病理分期以及Gleason评分不相关。基于CTCs的生物学特征，在肿瘤早期即有肿瘤细胞进入血循环。因此，检测CTCs是否有助于前列腺癌的早期诊断仍待大规模的临床研究。

　　预后判断和疗效评估 目前的研究显示，CTCs数目和肿瘤的进展、接受药物治疗后的疗效密切相关。Bono等研究入组了276 例CRPC患者，利用CellSearch平台在治疗前后按月对患者外周血CTCs进行持续动态监测，研究发现以CTCs 5个/7.5 ml为Cutoff值，治疗前的CTCs基线水平对患者的中位OS具有预测价值，这项研究直接促使FDA 批准CellSearch System(CSS) 用于前列腺癌患者外周血中CTC的检测。Goodman等研究对33例mHRPC患者内分泌治疗前及内分泌治疗2个月后进行CTC计数及血生化指标的检测，统计学结果显示多因素分析中仅基线CTC计数为mHRPC患者进展至CRPC的独立预后因素。后续更多学者对发生转移的前列腺癌患者进行多变量分析，证实CTCs对判断前列腺癌患者预后生存具有重要价值，其可以作为判断患者OS以及PFS的独立预测因子。

　　Okegawa等对80例接受内分泌治疗的转移性前列腺癌患者的CTCs进行了研究，44例（55%）检出≥5个（7.5 ml外周血），其内分泌治疗中位有效期为17个月；小于5个的患者的内分泌治疗中位有效期大于32个月。Goldkorn等运用多西他赛联合醋酸泼尼松治疗mCRPC患者的过程中，上升的CTC与OS呈现明显负相关（HR=2.55）。Stott等使用CTC-Chip技术对19例局限性前列腺癌患者外周血进行CTCs 计数研究，8例患者检测到CTCs，术后24 h再次检测，8例患者中6例CTCs计数明显下降，另外2例患者在术后3个月内也明显下降，术后1年内均未检测到复发。

　　大量研究已经证实CTC计数为前列腺癌患者的敏感预后因子和治疗疗效评估的指标。但是，在CTC的临床应用中仍存在一些问题，例如对于CTC预测预后的最佳临界值仍有争议，CTC在低肿瘤负担的晚期前列腺癌患者中的预测价值有待进一步评估。

　　此外，CTCs的检测已经作为一种预后标记物被纳入研发前列腺癌的新型靶向治疗药物的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验中，其中有项关于阿比特龙治疗去势抵抗性前列腺癌的Ⅱ期试验，该试验显示，60%～70%的患者初始CTCs较高，经过阿比特龙治疗后，近一半患者的CTCs降到较低水平。这些研究充分证明了CTCs可作为反映抗肿瘤治疗疗效的指标，其在临床新型治疗方法的研发中具有重要作用。这为优化治疗方案提供了早期依据。

　　CTCs分子标志物检测 由于在前列腺癌疾病进展过程中，促进肿瘤发展的分子标志物可能会发生变化。为了实现有效的个体化治疗，根据肿瘤所表达分子特征选择治疗方案至关重要。

　　国外学者研究发现前列腺癌患者CTC中TMPRSS2-ERG基因融合、雄激素受体（AR）突变及雄激素受体剪切变异体-7（AR-V7）突变，往往提示前列腺癌更具侵袭性及对恩杂鲁胺和阿比特龙耐药。其他CTCs水平分子特征分析的内容还包括PTEN缺失、扩增和MYC的扩增，CTCs中Ki-67增殖很大程度上提示前列腺癌患者容易发生去势抵抗，AR蛋白的改变与临床对多西他赛的反应相关，还有对CTCs细胞的微管束研究也发现其与多西他赛化疗的疗效相关。因此，检测CRPC患者外周血CTC中AR的亚细胞水平可以预测患者对多西他赛、阿比特龙的反应，对治疗方案的选择和更换具有重要意义。

　　国内复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科团队收集了70例mCRPC患者和20例健康人的外周血标本，利用CellSearch方法完成CTC的计数，利用Taqman探针的Realtime-PCR方法完成对CTC的干细胞标记物检测。结果发现联合应用CTC计数和干细胞标记物检测的方法，可以比单用计数法，更好的预测mCRPC患者的预后。CTC中干细胞标记物表达阳性的患者相比阴性患者，前者对多西他赛联合强的松治疗的疗效较差。

ctDNA的概念及生物学特征

　　血浆游离DNA（cell-free DNA， cfDNA）是外周血中游离存在、不包含在完整细胞结构内的DNA。循环肿瘤DNA(circulating tumor， ctDNA)来源于肿瘤细胞的cfDNA，属于cfDNA的一种类型，主要存在于血液、滑膜液和脑脊液等液体中，可经尿液和粪便排出，含量极微。通过对cfDNA中肿瘤特异性的畸变（如肿瘤原癌基因和致癌基因突变、微卫星改变和DNA甲基化等)的识别，证实其为肿瘤细胞来源的cfDNA，且与肿瘤细胞基因组信息相一致。ctDNA主要来源于：①来自于坏死的肿瘤细胞；②来自于凋亡的肿瘤细胞；③CTC；④来自于肿瘤细胞分泌的外排体。

　　作为cfDNA中的一类，来源于肿瘤细胞的ctDNA携带有肿瘤患者的基因信息，可以间接反映肿瘤疾病的相关特征，定量或定性分析这些循环 DNA 对肿瘤的早期诊断、个体化治疗、病情监测及预后的评价都具有重要意义。

ctDNA的检测方法进展

　　同CTC检测一样，建立有效、可靠的标准化ctDNA检测方法是将其应用于临床的必要前提。对cfDNA的检测可分为定量和定性两种：前者主要检测血清和血浆的DNA总量血，后者则检测清和血浆中肿瘤特异性基因的改变。对于定量检测，既往缺乏统一标准，再加上操作技术的限制，导致其定量检测一直未收重视。随着放射免疫分析和对流免疫电泳技术的发展，DNA检测灵敏度有了较大的提高，可以检测纳克级(ng)的DNA。ctDNA 的定性分析是指对肿瘤特异性基因改变的检测。理论上，任何肿瘤相关的遗传学和表遗传学改变均可以用来进行检测。而目前临床上，主要开展的检测包括基因突变、甲基化异常、微卫星不稳定性和杂合性缺失等。

　　ctDNA在肿瘤疾病(甚至进展期)的含量都是非常稀少的，与cfDNA的含量相比甚至<0.01%。因此，上述常规检测手段不一定能有效的从cfDNA中区别目标ctDNA并加以检测。二代测序技术的发展则使ctDNA中肿瘤特异性的基因突变或是拷贝数异常的检测成为可能。而且这种高通量的方式具有非常高的敏感性，并能精确的捕捉到临床治疗过程中微量ctDNA的变化。

ctDNA在前列腺癌中的临床应用

　　目前关于恶性肿瘤诊断的研究聚焦于患者ctDNA含量与正常人之间的差异。多项研究相继证实，在结肠癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤患者外周血中的ctDNA含量与正常人存在明显差异。针对前列腺癌，Altimari等在2008年的一项研究显示，临床局限型前列腺癌患者（64例）的cfDNA水平(15.4±0.9 ng/mL)明显高于健康男性（45%）的cfDNA(5.5±3.5 ng/mL)（P<0.001），其敏感度和特异度分别达到了82%和80%，并且血浆游离DNA水平还和前列腺癌分期相关，T3期的前列腺癌患者其cfDNA水平明显高于T2期者(17.5 ±12.1 vs 12.6 ± 8.4 ng/mL; P＜0.05)。目前有关cfDNA应用于前列腺癌诊断的研究数据尚少，但这些研究视野的拓展和新发现，为肿瘤的早发现、早诊断提供了新的思路和方法。

　　近年来，有关cfDNA水平变化与抗肿瘤（包括手术、放疗、新辅助化疗、姑息性化疗等）疗效预测方面的研究陆续出现。Kienel等入组了59例前列腺癌患者，其中48例（81.4%）接受多西他赛化疗的CRPC患者的cfDNA下降水平和PSA下降幅度呈负相关，而在评价生存期方面，基线cfDNA≥55 ng/ml（5例）和＜55 ng/ml的PFS分别为9.4和7.5月，OS分别为17.0和31.5月。

　　上述一系列研究主要从cfDNA的整体水平变化进行探讨，针对与疾病关系明确的DNA片段进行定性分析可为肿瘤个体化治疗提供实验依据。Lallous等通过对CRPC患者外周血cfDNA进行基因组定性分析，以ctDNA中检测到的AR BF3位点为靶点的恩杂鲁胺在CRPC患者中可有效阻碍其他所有24个AR突变的活性。通过对cfDNA中的ctDNA进行定性，进而进行基因分析可为CRPC患者提供更精准的治疗。对前列腺癌中ctDNA进行定性分析的研究尚属少数，探索ctDNA在前列腺癌中应用仍需更多、更大规模的研究。

　　ctDNA可以直接从患者的外周血中获取，有望发展成为一种新型的肿瘤学监测指标。作为一种灵敏、特异、无创的分子生物学检测手段，检测ctDNA可以便捷地对肿瘤做出早期诊断、进行疗效监测及对恶性肿瘤做出预后评价，可应用于肿瘤的预防以及个体化治疗的开展。

结语

　　CTC和ctDNA还有很多问题值得去探索，富集、检测技术的改进，辅助前列腺癌诊断、预后判断及疗效监测都需要进一步、大规模的临床数据证实。

专家简介

戴波：主任医师，副教授，硕士生导师，医学博士，上海复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科副主任。中国抗癌协会泌尿男生殖系肿瘤专业委员会青年委员会副主任委员；上海市泌尿外科学会青年委员。

长期从事泌尿系统肿瘤的临床诊治与基础研究工作，在国内外一流学术刊物上以第一作者或通讯作者发表科学论文50余篇，其中SCI收录论文24篇。先后被评为：复旦大学十大医务青年、上海市卫生系统优秀青年人才、仁心医者（上海市杰出专科医师奖提名奖）。当前主要研究方向包括：泌尿系统肿瘤的复发和转移机制。前列腺癌的早期诊断策略、多学科综合治疗策略的优化、去势抵抗性前列腺癌的预后判断和个体化治疗方案的研究。