编者按：多发性骨髓瘤（MM）是一种克隆性浆细胞异常增殖的恶性疾病，由于肿瘤细胞本身的遗传异质性强，加之肿瘤微环境对其复杂的调控作用，使得MM的发病机制目前尚未完全阐明。近年来，随着分子生物学及二代测序（NGS）技术的飞速发展，围绕MM分子病理，尤其是克隆演化方面的研究不断深入，为实现MM的精准诊疗奠定了基础。近日，北京同仁医院血液科王亮教授团队在Mol Cancer杂志（2022年影响因子：41.444，JCR分区：Q1）发表了的一项最新研究成果，采用单细胞转录组测序技术（scRNA-seq），从单细胞层面分析了多发性骨髓瘤克隆演化和肿瘤微环境重编程，并且提出了有针对性的MM个体化治疗策略。本刊特邀请王亮教授团队梁远征博士给大家带分享了该项研究成果，并进行综合报道，以飨读者。

 

 

MM是一类克隆性浆细胞异常增殖的恶性疾病，十年来其年龄标化的发病率逐年升高。最新的数据显示（见图1），2020年预估全球共报告17，6404例MM新发病例，占血液系统肿瘤第三位（14%）;有11，7077例新报告的MM死亡；2020年MM全球年龄标化发病率和死亡率分别为1.78/10万人和1.14/10万人；2020年中国MM年龄标化发病率在0.67-1.10/10万人；年龄标化死亡率为0.59-0.94/10万人。

 

图1.2020年全球多发性骨髓瘤发病率和死亡率

（引自报告幻灯）

 

 

MM是一类具有高度异质性和高度依赖骨髓微环境的疾病，伴有广泛的遗传学异常。染色体不稳定性（CIN）和肿瘤微环境（TME）是MM难以治愈的两大关键因素。单细胞层面上探索MM克隆进化有更高的分辨率。然而，目前在单细胞层面上探索骨髓瘤克隆进化的研究还比较少。

 

我们中心纳入7例MM患者，包括3例新诊断MM（NDMM）、4例复发难治MM（RRMM），其中1例为CD20+RRMM。首先通过流式确认7例MM患者的恶性浆细胞表型（CD38+CD138+CD56+CD19-CD20-/CD20+），然后通过scRNA-seq识别恶性浆细胞并进行降维聚类，构建了恶性浆细胞的单细胞图谱，确定了11种恶性浆细胞亚簇（图2）。热图显示恶性浆细胞不同簇间基因表达存在明显差异（图2）。

 

图2.单细胞水平上的MM恶性浆细胞图谱

（引自报告幻灯）

 

通过拟时序分析，细胞周期分析，细胞干性评分，确定I型和IX型为恶性浆细胞亚簇的祖细胞。同时应用RNA速率分析，在单细胞层面上推测不同亚克隆的演化轨迹，确定各个亚簇间的演化方向，VI型为克隆演化的终点，仅存在于RRMM中，考虑VI型为耐药后的优势亚克隆。KEGG通路分析显示I型亚簇富集在铁死亡、造血、糖酵解、HIF-1等相关通路；IX型亚簇主要富集在细胞周期、细胞凋亡、糖酵解、P53及HIF-1等相关通路（图3）。

 

图3.单细胞层面上确定MM克隆演化轨迹

（引自报告幻灯）

 

热图显示I型和IX型恶性祖细胞在各自特定表达基因集中有显著的活性改变（GSVA评分升高）。IX型细胞周期和肿瘤干性评分均高于I型，提示恶性程度更高。提取I型和IX型恶性浆细胞亚簇的特征性基因（Log2FC＞1），在大规模临床MM患者队列（共纳入9574例患者，来自24个独立数据集）中分析这两种MM亚型的基因表达情况，确定患者恶性起源，并进行分组。大规模临床队列分析中MM恶性起源可分四型；I型和IX型双阳组（DP）；I型和IX型双阴组（DN）；I型阳性组；IX型阳性组。生存分析显示，I型和IX型双阳组MM患者的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）最差；IX型预后差于I型（见图4）。

 

图4.大规模队列中验证I型和IX型MM恶性祖细胞预后

（引自报告幻灯）

 

 

此外，我们还探索了MM骨髓微环境中免疫细胞的情况。首先，通过1例健康骨髓对照样本，经过scRNA分析构建了正常骨髓微环境中免疫细胞的单细胞图谱，注释得到16种免疫细胞类型。根据这16种免疫细胞类型的特异性marker的表达情况，通过scRNA分析对MM患者中的微环境细胞进行分群，注释，降维聚类得到MM骨髓微环境中免疫细胞的单细胞图谱（图5）。同时构建了MM骨髓中B细胞、浆细胞、CTL细胞、T细胞、NK细胞、cDC细胞、Mono细胞的单细胞图谱。

 

图5.正常对照和MM患者骨髓微环境免疫细胞的单细胞图谱

（引自报告幻灯）

 

进一步分析发现MM骨髓微环境中免疫细胞表达恶性浆细胞亚克隆簇的特异性基因（例如IGHG3，IGLC2，IGHG2等，图6），IGHG3主要表达在RRMM1，涉及Plasma-1、CTL-0、T-2、NK-0、cDC-2、Mono-3亚簇；IGLC2仅在RRMM2中特异性表达，涉及CTL-1、T-5、NK-2、cDC-0和Mono-2亚簇；IGHG2仅在RRMM3中特异性表达，涉及CTL-2和NK-4亚簇。这些恶性浆细胞亚克隆簇的特异性基因在健康对照组患者免疫细胞未见表达，说明MM恶性浆细胞在克隆进化中对微环境中免疫细胞进行重编程，介导患者异质性。

 

图6.MM中恶性浆细胞亚克隆簇特异性基因的表达

（引自报告幻灯）

 

更进一步的探索恶性浆细胞重编程微环境免疫细胞的机制，我们的研究发现在MM恶性细胞的克隆进化过程中，表达了细胞外泌体囊泡合成的关键基因CD63，且在GO分析中可看到不同程度地激活了一系列与囊泡合成和分泌相关的生物通路（图7）。因此可能是由于恶性浆细胞通过外泌体合成，分泌富含恶性浆细胞标记mRNA的囊泡到微环境中，由于克隆进化过程中微环境免疫细胞被激活的吞噬作用，导致免疫细胞吞噬这些囊泡，微环境中免疫细胞被重编程相应基因的表达。

 

图7.MM恶性浆细胞亚簇中CD63的表达情况

（引自报告幻灯）

 

回顾恶性浆细胞的差异基因表达情况，CCL5在这些恶性浆细胞亚簇中均阴性表达，这导致无法招募CTL细胞在肿瘤病灶浸润，且恶性克隆标志物基因重编程微环境，激活免疫检查点PD-1和PD-L1信号通路，反过来增强免疫逃逸，使各类发挥杀伤作用的免疫细胞处于“功能耗竭状态”。总体正向加持，促使肿瘤发生发展。

 

CCL5表达下调所介导的免疫逃逸不仅发生在实体肿瘤中，也发生在MM中，这是MM免疫治疗的一个新的生物标志物和候选靶点。有研究表明，癌细胞中CCL5表达的缺失与DNA的化学修饰有关，这种修饰抑制了靶向基因的表达——这是一种被称为表观遗传沉默的机制。CCL5的表观遗传沉默是肿瘤逃避免疫攻击的一种适应性机制。CCL5的沉默可以通过药物地西他滨来逆转，这为将表观遗传疗法与PD1阻断相结合，提高免疫检查点抑制剂对MM的敏感性提供了强有力的理论依据。

 

▌原文链接：

 

Liang Y，He H，Wang W，Wang H，Mo S，Fu R，Liu X，Song Q，Xia Z，Wang L.Malignant clonal evolution drives multiple myeloma cellular ecological diversity and microenvironment reprogramming.Mol Cancer.2022 Sep 22;21(1):182.doi:10.1186/s12943-022-01648-z.PMID:36131282;PMCID:PMC9492468.